El Research Day de Biominds fue una tremenda actividad donde tuvimos la oportunidad de presentar los resultados nuestros proyectos de investigación a los demás compañeros y profesores. Tuve la oportunidad de ver tres trabajos de investigación muy diferentes al mío de los cuales aprendí muchos nuevos conceptos y las diferentes técnicas que se utilizan en las diferentes ramas. El 1ero fue el de Jessenia Yaris Laguna el cual se titulaba “Identifying genes potentially regulated in the hippocampus by DNA recombination”. La hipótesis de su proyecto era que la formación de memoria a largo plazo envuelve un mecanismo regulatorio de recombinación de ADN en el hipocampo que incluye la activación de moléculas efectoras, como ligasas, y el rearreglo de genes blanco específicos. El otro proyecto se titulaba “Synthesis of Platinum II complexes of the type cis[PtCl2(Am2)]” de la estudiante Irielies Melendez Rodriguez. El propósito de su investigación es lograr sustituir los ligandos aminos en cisplatin con ligandos mas grandes para retrasar la sustitución de los iones de Cl y como resultado reducir reacciones no deseadas entre platino y componentes celulares como glutationa. El último proyecto que tuve la oportunidad de visitar fue “Vibrations study of interactions between glutathione and cis[Ptc(NH3)2 (thiazole)]+” por R. Arroyave. Su proyecto es sobre estudios de espectroscopia de la interacción entre cis-[Pt(NH3)2(thiazole)Cl]NO3 y glutaniona. Este programa nos ha brindado la oportunidad de crecer en el campo que escogimos estudiar mucho más allá de los salones de clase y por eso me siento muy agradecida. Termino este programa con mucho más experiencia en técnicas de laboratorio, análisis y comprensión y redacción de literatura científica que serán muy útiles para mi carrera.
entrada 27-feb/ abstract February 27, 2009
Por el memento seguimos tratando de optimizar las condiciones para transfectar el promotor de CHDL-1 en el vector pGL4 utilizando nuevas enzimas de restricción y tratando de obtener la mayor cantidad posible del vector cortado. Además volvimos amplificar los diferentes fragmentos de la región promotora que pronto intentaremos clonar nuevamente al vector. Mientras tanto he aprendido una nueva técnica de laboratorio llamada “electrophoretic mobility shift assay” (EMSA). Esta técnica es basada en la observación de que los complejos de ADN-proteína migran más lento que las moléculas de ADN libre cuando se corren en un gel de electroforesis. Esta técnica nos ayudara a identificar la interacción de la región promotora de CHDL-1 con TWIST 2 y otras proteínas de interés.
Como solo llevo un semestre trabajando con este nuevo proyecto titulado “Mechanisms of gene regulation by the bHLH transcription factor TWIST 2”, todavía no he obtenido suficiente data para presentar en un poster. Decidí por lo tanto presentar mi proyecto anterior con el cual originalmente comencé en Biominds. Aquí les presento el abstract del poster que presentaré el sábado, 21 de marzo en el “Annual Presentation Day”.
Prevalence of CYP2C19 Gene Polymorphisms in the Puerto Rican Newborn Population
P. Silen-Rivera1, J. Duconge2, P. Piovanetti1, L. M. Castro-Rosario1, J. Y. Renta1, P. J. Santiago Borrero3, John Guerra3 and C. L. Cadilla1
School of Medicine, University of Puerto Rico Medical Sciences Campus. School of Pharmacy2, University of Puerto Rico Medical Sciences Campus1 Depts. of Biochemistry1 and Pediatrics3
Polymorphisms in the cytochrome P450 2C19 gene (CYP2C19 *2, splicing defect 681G>A, and *3, stop codon 636G>A) significantly alter the metabolism of some prescription drugs. We determined the frequencies of these alleles and genotypes, single and double carriers, in a Puerto Rican cohort and tested for the Hardy-Weinberg equilibrium assumption. A total of 122 DNA samples from the Puerto Rican Newborn Screening Program were genotyped using both PCR-based restriction fragment length polymorphism (RFLP) method and the physiogenomic (PG)-array technology. The polymorphism frequency for CYP2C19*2 allele was 0.139. The prevalence of genotypes for this clinically relevant mutation was 24.6% single carrier (heterozygous) and 1.64% double-carrier. Genotypes met Hardy-Weinberg equilibrium (p>0.01). The findings were confirmed by PG analysis using Illumina BeadArrayTM technology. No carriers for CYP2C19*3 mutation were detected, suggesting a very low frequency for this allele in the Puerto Rican population. This variant is considered rare in non-Asian descendant population. Considering the observed prevalence of CYP2C19*2 polymorphisms in Puerto Ricans, it is necessary to make local healthcare providers aware of the CYP2C19-related pharmacogenetics in order to achieve better clinical outcomes by developing DNA-guided personalized algorithms. This project has received support from NIH grants R25GM61838 and P20RR011126, as well as from the PRNSP of the UPR School of Medicine and the Bio-Minds program.
entrada enero-27-09 January 28, 2009
Por el momento me encuentro recuperándome de una operación de la rodilla (reconstrucción del ligamento anterior cruzado) y no he podido asistir al laboratorio. Espero poder comenzar a asistir en dos semanas. En las próximas semanas me reuniré con mi mentora para establecer cuales serán los objetivos para este nuevo semestre. A mi entender continuaremos tratando de clonar los fragmentos del promotor de CHDL-1 en el vector pGL4 para luego proceder a transfretar las células Hela con los plasmidios extraídos y finalmente llevar a cabo los ensayos de luciferasa.
El trabajo de este semestre es continuación del trabajo hecho el semestre anterior. Al finalizar el semestre pasado estábamos teniendo problemas clonando los fragmentos del promotor en el vector pGL-4. Este semestre trataremos de optimizar las condiciones de esta clonación para poder seguir adelante con la investigación.
La técnica mas importante que estaré llevando a cabo es el ensayo del gen reportero específicamente el de luciferasa. Estos genes se pueden usar para ver la actividad de un promotor particular en un organismo. El gen reportero se encuentra bajo el control del promotor y la actividad del producto del gen reportero es medida cuantitativamente. El producto del gen reportero de luciferasa es la expresión de una fluorescencia por la catalización de una reacción de enzima luciferasa con luciferin. Adjunto un esquema del proceso. 
nov. 25 November 25, 2008
El gen TWIST 2 es un factor de transcripción que pertenece a la familia de bHLH. Dos mutaciones (Q119X y Q65X) en TWIST 2 codifican para la forma truncada de los factores de trascripción que son postulados a causar el síndrome setleis. Este síndrome esta caracterizada por desarrollo craneal y facial anormal. Por ahora la forma normal de TWIST 2 fue clonada en un vector de expresión pCl-neo y marcada en el terminal amino con un epítope Myc produciendo una proteína recombinante. Este constructo fue luego transfectado en células Hela usando un método basado en lípidos. Los niveles de expresión de la proteína fueron analizados utilizando western blots. Todo esto se realizó para optimizar las condiciones con las que se tranfectaran las células Hela. Actualmente estamos en el proceso de preparar los constructos de las regiones regulatorias de CHRDL1 y clonandolos en el vector reportero pGL4 . Si se logra completar lo antes mencionado la semana entrante espero obtener los resultados del ensayo de gen reportero pGL4. Los resultados de estos ensayos me dejaran saber con qué regiones de CHRDL1 es que interactúa TWIST 2. El trabajar en este nuevo proyecto ha sido una experiencia muy enriquecedora y he tenido la oportunidad de en el poco tiempo aprender nuevas técnicas y familiarizarme muy bien con el proyecto. Espero para el semestre próximo continuar con el mismo proyecto y terminar los objetivos que no se pudieron completar en este semestre. Además espero aprender nuevas técnicas y trazar nuevos objetivos para poder determinar si Twist 2 regula a CHRDL1 de manera directa y que mecanismo utiliza.
entrada oct 25 October 30, 2008
Como cambie de proyecto me tomo tiempo el llevar a cabo la revisión de literatura necesaria para entender el mismo y el aprender las nuevas técnicas que eran necesarias para poder lograr mis objetivos. Además he estado ocupada también preparando el poster de ABRCMS de mi proyecto anterior. Sin embargo creo que he logrado al menos 30% de los objetivos propuestos. Ya optimizamos las condiciones de transfección de las Hela y estamos en el proceso de preparar los constructos de la región reguladora de CHRLD 1 que será luego clonado al vector reportero pGL4. La importancia de este proyecto es que sirve para explicar la patofisiología de Syndrome de Setleis, descrito por primera vez en pacientes de origen puertorriqueño. El conocer como la mutación en el factor de transcripción TWIST 2 afecta otros genes como CHRLD 1 nos ayudara a entender de donde provienen las características físicas peculiares que presentan los pacientes con este síndrome.
Mechanisms of gene regulation by the bHLH transcription factor TWIST 2 October 7, 2008
The TWIST2 gene is a transcription factor that belongs to the family of basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors. Two nonsense mutations (Q119X and Q65X) in TWIST2 code for truncated forms of the transcription factor which are postulated to cause Setleis syndrome (MIM 227260). Setleis syndrome was first described in patients of Puerto Rican ancestry who presented with bilateral temporal marks similar to forceps marks, an aged leonine appearance, absent eyelashes on both lids or multiple rows on the upper lids and none on the lower lids, eyebrows that slanted sharply upward laterally, chin clefting and a rubbery feel of the nose and chin. All affected persons traced their ancestry to the towns of San Sebastian and Aguadilla (Setleis et al, 1963, Marion et al., 1987). No chromosomal abnormalities were found in these and other SS patients (Setleis et al, 1963, and many others).
Microarray analyses have been used to identify genes potentially regulated by the Setleis syndrome gene (TWIST 2) in human skin fibroblast cultures. Genes found to be differentially regulated in these cells include various genes involved in the inflammatory response, TGFb signaling, bone and skin growth and development. One of these genes is Chordin like-1 (CHRDL1), proposed to modulate the Bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway during formation of the neural plate. The objective of my project is to confirm Twist2 binding to elements in CHRDL1 regulatory regions (-3kb). We are interested in knowing if Twist2 regulates CHRDL1 directly and what is the mechanism it uses. This will be demonstrated performing a reporter gene assay. We expect TWIST 2 to interact directly with CHRDL1 regulatory regions suppressing the expression of this gene.
My role in this research project will be
· Preparing constructs of the CHRDL1 regulatory regions (-3kb) and cloning them to the pGL4 reporter vector.
· Transfect Hela cells that will be used in the reporter gene assay.
· Optimizing conditions for the Hela transfection.
sept-25 2nda entrada September 28, 2008
De las técnicas mas importantes que he podido aprender durante el tiempo transcurrido que me ayudaran a realizar mi nuevo proyecto son el cultivo de células y la transfección. El cultivo de células es el proceso por el cual tanto células procariotas como eucariotas pueden cultivarse en condiciones controladas. Estas condiciones son la temperatura, la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Al estar generalmente las células en continua división durante el cultivo, es normal que crezcan hasta ocupar todo el area disponible. Por esto es necesario cambiar el medio y hacerle pase a las células. Un método común en la manipulación de las células es la introducción de un DNA externo por transfección. Esto se lleva a cabo a menudo para conseguir que las células expresen una proteína de interés. En relación a mis objetivos he logrado alrededor de un 10%. He podido en el corto tiempo, hacer la revisión de literatura y aprender nuevas técnicas que me ayudaran a obtener alguna data significativa entes de terminar el semestre.
25 de agosto del 2008. August 26, 2008
Este verano se completo el proyecto de investigación de “La prevalencia del polimorfismo del gen CYP2C19 en la población puertorriqueña” y se hizo una publicación preliminar. Por esta razón mi mentora decidió cambiarme a otro proyecto que se titula “Mecanismo de regulación de genes por el factor de transcripción bHLH, TWIST 2” para familiarizarme con otro tema y aprender nuevas técnicas de laboratorio. Entre estas se encuentran: western blot, inmunofluorescencia, secuenciación, transfección, cultivo de células y clonación . Por ahora mis metas son llevar a cabo la revisión de literatura y aprender y dominar las nuevas técnicas. Mas adelante me reuniré con mi mentora para trazar metas especificas a corto y largo plazo.
4ta entrada/abril 25 April 25, 2008
Durante este semestre he aprendido mucho acerca de la función del citocromo P450 y como mutaciones en sus diferentes regiones afecta el metabolismo de ciertas drogas terapéuticas. Además he aprendido muchas técnicas nuevas de laboratorio como extracción de ADN y PCR-RFLP. Lo mas importante de todo es que he desarrollado mucha paciencia y he puesto en practica mis conocimientos de genética. Las barreras y retos que he enfrentado en mi proyecto son problemas con la amplificación del gen y contaminación. He logrado superar este problema con ayuda de los miembros de mi laboratorio y con mucho “troubleshooting” para optimizar mis PCR. Mis expectativas para el semestre próximo son terminar de analizar las 500 muestras para CYP2C19*2 y *3 y comenzar a analizar otra región del citrocromo P450.
Visita a los blogs y técnicas aprendidas April 2, 2008
Tuve la oportunidad de visitar 3 blogs de estudiantes de la UPRM. La primera fue Agnes Acevedo la cual esta llevando a acabo uno de los pocos proyectos teóricos de Bio Minds. Ella utiliza el campo de la bioinformática para comparar y analizar secuencias funcionales de integrasas de ambientes extremos de las cuales buscando sitios conservativos para luego realizar PCR. La segunda fue Paloma Monroig la cual esta llevando a cabo un estudio de monitoreo de agua de plantas de tratamiento con el fin de ver si se encuentran en ellas genes casetes provenientes del ambiente hospitalario los cuales se podrían insertarse en los integrones de bacterias no-resistentes a antibióticos. El tercero fue Nelson González el cual investiga la relación que existe entre los compuestos PAH’s (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) y los daños que puede ocasionar en las cadenas de DNA ya que la mayoría son carcinógenos y pueden causar otros problemas a la salud.
Las técnicas que he aprendido durante mi proyecto de investigación son: extracción de ADN, PCR-RFLP, electroforesis y analizar la frecuencia de las variantes en la población. A mi entender lo más importante no es aprender a llevar a cabo las técnicas si no diseñarlas para obtener la información que deseas. Durante esta experiencia pude ver la calidad de el ADN extraído ya que cuantifique mis muestras, diseñar primers específicos para las regiones de interés, diseñar un programa optimo para llevara cabo el PCR, y enzimas de restricción que me permitieran ver si la variante mutante esta presente en una gel de agarosa. Además pude poner en práctica el conocimiento del equilibrio Hardy Weingber para los genes de CYP2C19 en la población de P.R.
